Молекулярные механизмы регуляции функционирования Р-гликопротеина в условиях окислительного стресса in vitro
Научное направление: междисциплинарные биомедицинские исследования: молекулярная медицина
1 место
Проект представил: Щулькин Алексей Владимирович
Авторы: 1) Щулькин А.В. – д.м.н., профессор кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО, 33 года;
2) Абаленихина Ю.В. – к.б.н., доцент кафедры биологической химии с курсом КЛД, 32 года;
3) Мыльников П.Ю. – аспирант кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО, 26 лет;
4) Ерохина П.Д. – ординатор по специальности «терапия», 24 года;
5) Сеидкулиева А.А. – студент 5 курса фармацевтического факультета, 22 года
Научный руководитель: Щулькин Алексей Владимирович
Организация: Рязанский ГМУ им. академика И.П. Павлова
Актуальность, научная новизна:
АВС-транспортеры (АTP-binding cassette) – АТФ-зависимые белки-транспортеры, обеспечивающие энергозависимый перенос веществ через цитоплазматические мембраны. АВС-транспортеры выявлены в трех доменах (надцарствах) биологических видов – бактериях, археях и эукариотах, а также в некоторых гигантских вирусах (Davidson A.L. 2008). Геном человека включает 49 генов АВС-транспортеров, объединенных в семь подсемейств (обозначаемых A-G). Нарушение функционирования 18 транспортеров связано с развитием заболеваний (ABCC7 – муковисцидоз, ABCB11 – прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз и др.), а 20 из них вовлечены в транспорт лекарственных веществ (Vasiliou V. et al., 2009). АВС-транспортеры имеют общую структурную организацию. Каждая молекула переносчика состоит из двух трансмембранных доменов (transmembrane domains – TMD), которые образуют транспортный канал и обеспечивают распознавание и связывание субстратов, и двух нуклеотидсвязывающих доменов (nucleotide-binding domains – NBD), которые гидролизуют АТФ (Esser L. et al., 2017).
Самым изученным белком из суперсемейства АВС-транспортеров является Р-гликопротеин (белок множественной лекарственной устойчивости 1, P-gp, ABCB1-белок, MDR1) (Sharom F.J., 2011). Р-gp представляет собой крупный трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 170 кДа (из них 150 кДа приходится на пептидную часть). P-gp обладает широкой субстратной специфичностью. Его субстратами являются преимущественно липофильные вещества с молекулярной массой 330 – 4000 Да, относящиеся к следующим фармакологическим группам: противоопухолевые, гипотензивные и антигистаминные препараты, сердечные гликозиды, антиагреганты, антикоагулянты, стероидные и тиреоидные гормоны, антибиотики, ингибиторы ВИЧ-протеиназы, иммунодепрессанты и др. (Кукес В.Г. и др., 2008).
Впервые P-gp был выделен Juliano R.L. и Ling V. в 1976 г. из цитоплазматической мембраны клеток яичника китайского хомячка, отобранных по устойчивости к колхицину и демонстрирующих перекрестную резистентность к широкому спектру амфифильных веществ (Juliano, R.L., Ling, V., 1976). В дальнейшем этот белок-транспортер был обнаружен в энтероцитах кишечника, гепатоцитах, эпителиальных клетках почечных канальцев, эндотелиальных клетках гистогематических барьеров. Поэтому в настоящее время принято считать, что P-gp играет важную роль в развитии резистентности опухолей к химиотерапии, а также в транспорте эндогенных и экзогенных веществ (Borst P., Schinkel, A.H., 2013).
Активность и экспрессия P-gp могут изменяться под воздействием различных химических веществ, факторов внешней среды и патологических процессов (Yano K., Tomono T., Ogihara T., 2018)). Например, рифампицин и гипоксия могут повышать функционирование белка-транспортера, а циклоспорин и верапамил его снижают, что может влиять на проникновение субстратов белка-транспортера внутрь клеток через цитоплазматическую мембрану (снижать или повышать соответственно) (Кукес В.Г. и др., 2008).
Согласно современным представлениям, активность Pgp может изменяться в результате следующих процессов (Якушева Е.Н. и др., 2014):
1) изменение экспрессии гена MDR1;
2) полиморфизм гена MDR1;
3) увеличение дозы гена – амплификация участка генома, содержащего ген MDR1;
4) стабилизация мРНК гена MDR1;
5) передача Pgp между клетками;
6) изменение активности синтезированного белка-транспортера;
7) изменение метаболизма клеток.
При этом ключевую роль в регуляции активности Pgp играет уровень экспрессии гена MDR1. В нормальных и трансформированных клетках она инициируется сигналами от большого количества стимулов, которые сходятся на общей области промотора гена MDR1, называемого «MDR1 enhanceosome» (Johnson R.A., 2001). Эта область включает сайты связывания транскрипционного фактора NF-Y, Sp семейства GC связываемых транскрипционных факторов, а также прегнан-Х-рецептора (PXR) (Geick A. et al., 2001; Kathleen W. et al., 2001). Ядерный PXR представляет собой белковый транскрипционный фактор, распознающий специфические последовательности в промоторах или энхансерах генов-мишеней и модулирующий их экспрессию (Biswas A. et al., 2009; Harmsen S. et al., 2013). Данный транскрипционный фактор рассматривается как сенсор ксенобиотиков, оказывающий регулирующее воздействие на транскрипцию генов транспортеров лекарственных средств (в том числе Pgp), а также ключевых ферментов метаболизма (Biswas A. et al., 2009). Аналогичную функцию выполняет и конститутивный андростановый рецептор (CAR). Показано, что CAR и PXR могут связывается с респонсивным элементом ядерного рецептора в области 7.8 пар килобаз энхансера гена MDR1 и активируют его экспрессию через DR4 мотив, с которым данные рецепторы связываются в качестве гетеродимера с рецептором ретиноевой кислоты или в качестве мономера (Burk et al., 2005, Geik et al., 2001).
Исследования, проведенные в 60–80-х гг. ХХ века показали, что повышенная продукция активных форм кислорода (АФК) играет важную роль в патогенезе наиболее распространенных заболеваний человека (патология сердечно-сосудистой, дыхательной, эндокринной систем, злокачественные новообразования) (Ланкин В.З. и др., 2001, 2012; Liguori I. etal., 2018; Lushchak V., 2012;SemenzaG.L., 2004, 2011). Кроме того, было обосновано представление об общебиологической роли АФК, определенное количество которых образуется нейрохимическими и биоэнергетическими системами клетки в нормальных условиях, играя существенную роль в различных сторонах ее жизнедеятельности (Беленичев И.Ф., Ганчева О.В., 2004). Субстратами свободно-радикального окисления служат многие биологически важные соединения: белки, жиры, углеводы, нуклеиновые кислоты. Принято считать, что свободно-радикальному окислению в клетках подвергаются преимущественно молекулы липидов. По-видимому, это связано с тем, что АФК имеют высокую константу взаимодействия с полиненасыщенными жирными кислотами, являющимися основными структурными компонентами фосфолипидов мембран (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972;. Меньшикова Е.Б. и др., 2006; Ушкалова В.Н. и др. 1993). Однако рядом авторов было показано, что свободно-радикальному окислению подвергаются в первую очередь не липиды, а белки плазматических мембран. Причем модифицируется как полипептидная цепь, так и боковые части аминокислотных остатков, что может приводить к разрывам пептидной цепи и образованию различных стабильных метаболитов аминокислот (Попова Т.Н. и др., 2008; Bongarzone E.R. etal., 1995). Свободно-радикальное окисление липидов и других биомолекул приводит к развитию окислительного стресса, характеризующегося накоплением первичных (органические гидропероксиды) и вторичных (карбонильные соединения) высокотоксичных продуктов окисления в крови и тканях (Попова Т.Н. и др., 2008; Lankin V.Z., 2009).Окислительная модификация как липидов, так и белков приводит к изменению вязкости, упругости и текучести мембран, что существенно влияет на взаимодействие клеток между собой, на митоз и эндоцитоз (Tai W-Y. etal., 2010). Поэтому рядом исследователей клеточная мембрана рассматривается как биосенсор окислительного стресса (Benderitter M. etal., 2003; Sun Y. etal., 2012). Так как Pgp экспрессируется преимущественно в цитоплазматических мембранах, то логично предположить, что активация свободно-радикального окисления приведет к изменению функционирования данного белка-транспортера.
С другой стороны, образующиеся в результате окислительного стресса продукты пероксидации также могут повлиять экспрессию Pgp. В результате развития окислительного стресса происходит повреждение биомакромолекул с образованием токсичных продуктов (Halliwell B, Gutteridge J.M.C, 2015). Учитывая важную защитную роль CAR и PXR в инактивации и удалении ксенобиотиков, логично предположить, что данные транскрипционные факторы принимают участие и в защите клеток от продуктов пероксидации, в том числе повлияв на экспрессию изучаемого белка-транспортера.
Кроме того, гиперпродукция АФК и развитие окислительного стресса увеличивают экспрессию редокс-чувствительного транскрипционного фактора Nrf2 (NF-E2-related factor 2) (Raghunath A., et al., 2018), который, в свою очередь, также может повысить экспрессию Pgp.
Практическая значимость:
Учитывая важную роль Pgp в фармакокинетике широкого спектра лекарственных веществ, а также его участие в развитии резистентных к фармакотерапии форм заболеваний (эпилепсия, опухоли), изучение влияния окислительного стресса на активность данного белка-транспортера позволит существенно повысить эффективность и безопасность проводимой терапии. Например, в исследовании in vivo нами показано, что антиоксидант этилметилгидроксипиридинасукцинат (Якушева Е.Н и др., 2015) ингибирует активность Pgp, что может способствовать повышению проникновения веществ субстратов Pgp через гематоэнцефалический барьер и в опухолевые клетки и что необходимо учитывать при прогнозировании межлекарственных взаимодействий.